如何檢測短壽命自由基？ 自旋捕獲電子順磁共振方法介紹（一）

自旋捕獲電子順磁共振方法是將自旋捕獲技術與電子順磁共振技術相結合，從而檢測短壽命自由基的一種方法。

圖片來源：攝圖網

為什么使用自旋捕獲技術？

自由基，是指化合物分子在光熱等外界條件下，共價鍵發生均裂而形成的具有不成對電子的原子或基團，其廣泛存在于自然界中。

隨著生物、化學、醫學等交叉學科的發展，科學家們發現，許多疾病都與自由基相關。但由于其性質活潑、反應性強，反應中產生的自由基在常溫下往往不穩定，很難使用常規電子順磁共振波譜方法進行直接檢測。

雖然通過時間分辨EPR技術或者低溫快速冷凍技術可研究短壽命自由基，但對大多數生物體系中的自由基而言，其較低的濃度限制了上述技術的實施。而自旋捕獲技術，可通過間接方法，在常溫下實現短壽命自由基的檢測。

自旋捕獲技術的基本原理

在自旋捕獲實驗中，需要在體系中加入自旋捕獲劑（spin trap，能夠捕獲自由基的不飽和抗磁性物質）。加入自旋捕獲劑后，原本不穩定的自由基與捕獲劑會形成較穩定或壽命較長的自旋加合物（spin adduct），通過檢測自旋加合物的EPR譜圖，并對數據進行處理和分析，可反推出自由基的種類，從而間接檢測不穩定的自由基。

圖1 自旋捕獲技術的原理（以DMPO為例）

自旋捕獲劑的選擇

目前應用廣泛的自旋捕獲劑主要是硝酮或亞硝基化合物，典型捕獲劑有MNP（2-甲基-2-亞硝基丙烷二聚物）、PBN（N-叔丁基α苯基硝酮）、DMPO（5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物），結構如圖2所示。而一個優良的自旋捕獲劑需要滿足三個條件：

1.自旋捕獲劑與不穩定自由基形成的自旋加合物應性質穩定，壽命較長；

2.自旋捕獲劑與各種不穩定自由基形成的自旋加合物的EPR譜圖應易于區分和識別；

3.自旋捕獲劑易與多種自由基發生特異性反應，且無副反應。基于上述條件，目前廣泛應用于各行業的自旋捕獲劑為DMPO。

圖2 MNP、PBN、DMPO的化學結構示意圖

表1 常見自旋捕獲劑的比較

常見的自旋捕獲自由基種類

在自旋捕獲實驗中，最常見的為O-和N-中心自由基，如活性氧物種（ROS）、活性氮物種（RNS），但并非所有的ROS、RNS都是自由基，如圖3所示。除此之外，S-中心自由基，如硫酸根自由基等，也是較為常見的可用自旋捕獲方法研究的自由基。

圖3 常見的ROS與RNS

對于自旋捕獲實驗，捕獲劑加入的時間、捕獲劑濃度、體系的溶劑種類、體系pH等諸多因素均會影響實驗結果。因此針對不同的自由基，需合理選擇捕獲劑種類和濃度、合理設計實驗方案，最后通過EPR譜圖判斷自由基種類，還可利用化學手段消除自由基來對結果進行驗證。

圖4 DMPO捕獲的O-(a)、N-(b)、S-(c)中心自由基的EPR譜圖。

（數據由國儀量子EPR系列產品測試）

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